close

엔도톡신 제품

Endotoxin

천연 LAL 시약 유전자 재조합 LAL 시약 LAL 시험장비 LAL 소프트웨어 액세서리제품
천연 LAL 시약 유전자 재조합 LAL 시약 LAL 시험장비 LAL 소프트웨어 액세서리제품

엔도톡신 제품

LAL 시약

LAL 실험에 대한 소개

Limulus Amebocyte Lysate 실험은 그램 음성 박테리아의 외막에서 추출한 박테리아 내독소를 감지하고 정량을 측정하는 실험입니다. LAL 시약의 핵심 성분은 투구게(Limulus polyphemus)의 혈구(amebocytes)에서 추출됩니다.투구게의 혈액세포는 내 독소에 의해서 유발되는 혈액 응고 메커니즘의 단백질을 포함합니다.LAL시약은 주로 제약주사제,생물학적 제제 그리고 의료기기의 내독소를 테스트하는데 사용되며 또한 신장투석센터 및 기타 다양한 응용분야에서 사용됩니다. LAL 테스트는 미국약전(Chaper <85>의 박테리아 내독소 실험 항목에 설명 되어 있고 동일하게 유럽약전(Chapter 2.6.13) 그리고 일본약전(General Tests,No.4.01)의 세균 내독소 실험 항목에 기술되어 있습니다.

LAL 실험 방법

LAL테스트 방법에는 겔화법(gel-clot),비탁법 (Turbidimetric)과 비색법(chromogenic) 방법이 있습니다.
비탁법(Tubidimetric)과 비색법(Chromogenic)은 광학적 판독 장치(Optical Reader)가 필요하기 때문에 측광법(photometric method)라고도 합니다.

1 겔화법(Gel-clot method)

겔화법(Gel-clot method)은 가장 간단한 LAL 실험법입니다. 겔의 형성은 샘플에 내독소의 존재를 나타냅니다. 이 실험 방법은 작은 튜브에서 수행되며 튜브를 뒤집어 수동으로 판독합니다. 최대 감도는 0.03EU/mL입니다.

비순환 수조(non-circulating water bath) 또는 건식 수조 인큐베이터(dry bath incubator) 필요

수동 읽기 실헙법

감도가 다른 시약 사용 가능: 0.25EU/ml, 0.125EU/ml, 0.06EU/ml,0.03 EU/mL

비탁법과 비색법에 비교하여 간섭에 덜 민감할 수 있음

미국, 유럽 및 일본 약전에 있는 대부분의 샘플에 대한 "기본지표”입니다. 다른 실험법이 불명확할 때 겔화법을 기본지표로 사용합니다.

2 비탁법(Turbidimetric Method)

응고 반응에 수반되는 광학 탁도 증가는 Pyros Kinetix® Flex 튜브 판독기 또는 인큐베이팅 마이크로플레이트 판독기에서 판독됩니다.
Pyros Kinetix® 또는 Pyros Kinetix® Flex 튜브 판독기에서 ACC사의 Pyrotell®-T 시약을 사용하면 최대 0.001EU/mL의 감도를 얻을 수 있습니다.

Pyros Kinetix® Flex 튜브 판독기 또는 인큐베이팅 마이크로플레이트 판독기가 필요합니다.

0.001 EU/mL의 최대 감도, LAL 업계에서 사용 가능한 최고 수준의 감도 제공

인큐베이팅 시간은 표준 곡선 범위에 따라 다름

높은 감도를 위해서는 간섭을 극복하기 위해 샘플을 좀 더 높은 희석 배수를 허용하여야 합니다.

3 비색법(Chromogenic Method)

LAL 시약은 합성기질로 만들어 졌습니다. 합성기질은 엔도톡신 활성화 효소에 의해서 가수분해가 일어 날 때 발색단을 만들어 냅니다.
LAL실험은 일반적으로 마이크로플레이트 리더에서 405nm에서 읽습니다. 0.001 EU/mL의 최대 감도는 Glucashield® 버퍼와 함께 ACC사의 Pyrochrome® 비색 시약을 사용할 때 달성할 수 있습니다.

튜브 리더기 또는 인큐베이팅 마이크로플레이트 리더기 필요

Glucashield® Buffer와 함께 ACC사의 Pyrochrome® 시약을 사용할 때 0.001 EU/mL의 최대 감도

전자적으로 저장된 데이터와 결과 출력물을 제공하는 정량 분석

배양 시간은 표준 곡선 범위에 따라 다름

더 높은 감도를 위해서는 간섭을 극복하기 위해 샘플 보다 큰 희석을 필요합니다.

Diazo 결합 종말점 실험 방법(540–550 nm에서 판독)을 옵션으로 사용할 수 있으며, 이 실험은 405 nm에서 빛을 흡수하는 샘플에 유용합니다.

LAL 실험법 선정 방법

어떤 LAL 실험법을 사용할지 결정할 때 다음 질문을 할 수 있습니다.

사용 가능한 예산은 얼마입니까?

규제 요건은 무엇입니까(규제요건이 있는 경우)?

어떤 유형의 제품 또는 샘플을 테스트할 예정입니까?

어떤 실험 감도가 필요합니까?

샘플에 대한 내독소(Endotoxin) 최소 기준은 무엇입니까?

실험 데이터의 전자적 저장이 필요합니까?

예산이 제한되어 있는 경우에는 광학 판독기가 필요하지 않은 겔화법이 가장 저렴한 방법입니다. 불투명 시료, 현탁액 또는 유색 시료의 경우 겔 응고법이 선택될 수 있지만 시료를 희석하면 측광법도 사용할 수 있습니다. 인큐베이팅 기능이 없는 광학 판독기(non-incubating optical reader)를 사용하는 경우 종말점 비색 실험법(endpoint chromogenic test)이 최선의 선택일 수 있습니다. 이 실험방법은 다른 측광 방법과 마찬가지로 실험결과를 출력하고 데이터를 전자적으로 저장할 수 있습니다. 동역학적 방법인 비색법과 비탁법은 가장 넓은 검출 범위를 가지고 있으며 정교한 소프트웨어가 필요합니다. 광도 측정 방법(photometric methods)은 가장 높은 감도를 제공합니다. 광도 측정 방법(photometric methods)은 낮은 내독소 농도를 감지할 수 있으며 간섭을 극복하는 데 최대 희석 배수를 찾아야 합니다.

실험 절차에 대한 개요

다음의 내용은 규정을 지켜야하는 산업군에서는 샘플의 제품 출시 테스트를 수행하기 위해 취해야 할 절차/단계를 설명하고 있습니다. 또한 규정을 지킬 필요가 없는 산업군 또는 실험결과만을 얻기 위한 경우라면 아래 샘플 특징 확인 실험(Product characterization)에 대한 설명을 참조하시기 바랍니다.

시약 감도 실험법

이 실험법을 Confirmation of Labeled Sensitivity Test라고 합니다.시약은 사양에 맞게 실험이 수행되는지 확인하기 위해 시약 감도 검사를 해야 하며, 실험수행자는 충분한 숙련도가 있어야 하며, 실험 수행자간의 변동성을 문서화해야 합니다. 이 모든 것을 검증하기 위해서는 샘플이 아닌 표준 내독소(CSE)만을 사용하여 검증하는 것이 필요합니다.

샘플 특징 확인 실험법

샘플 특징 확인 실험법을 Product Characterization Test라고 합니다. 내독소 오염 여부와 샘플 내에 존재할 수 있는 잠재적 간섭요인인 억제자(Inhibitor)을 희석 배율을 통해서 검사하는 실험법입니다. 이 실험법은 규정에서 요구하는 사항은 아니지만 샘플의 간섭을 극복하는 것은 좀 더 정확한 LAL실험에서 굉장히 중요합니다.이 실험은 일정량의 엔도톡신을 샘플에 넣어서 만든 양성 제품 대조군(PPC,Positive Product Control)과 순수샘플을 연속 희석(Serial Dilution)해서 실험을 진행합니다. 양성 제품 대조군(PPC,Positive Product Control)의 목적은 샘플에 첨가된 엔도톡신이 적절하게 검출되고 샘플 내의 억제자(Inhibitor)가 실험을 방해하지 않는다는 것을 검증하는 것입니다.이 실험법을 통해서 다음 단계의 실험인 간섭요인 검증 실험(Test for interfering Factors-Validation)을 하기 위한 샘플의 희석배수를 결정 합니다.실질 실험시 출하할 제품에 대한 내독소 기준은 선택한 희석배수에서 진행하여야 합니다.

간섭 요인 검증 실험법

간섭 요인 검증 실험법은 Test for Interfering Factors Test라고 합니다 간섭 요인 검증 실험법은 샘플 특징 확인 실험법(Product Characterization Test)을 통해서 검증된 특정 희석배수 하에서 샘플 내에 향상자(Enhancer)의 유무를 확인하는 실험법입니다. 이 실험법은 제품의 3개 롯트를 사용해서 양성 제품 대조군의 엔도톡신이 정해진 검출 기준에서 즉시 검출되는지를 확인합니다.

일상시험법

일상 실험법은 Routine Testing이라고 합니다. 이 실험법은 제품 출하를 위한 현장에서의 LAL실험 방법/절차에 대해서 검증하는 것입니다. 이 실험은 검증된 희석배수에서 진행이 되며 반드시 간섭요인을 확인하기 위한 양성 제품 대조군(PPC,Positive Product Control)이 포함됩니다. 일상 실험법에는 순수 샘플(Sample),음성 대조군(Negative Control)과 내독소 표준물(CSE)가 포함되어야 합니다. 의약품의 경우에는 규정에 따라서 롯트당 최소 3개 단위로 실험을 해야 하며, 샘플은 생산 실행의 시작, 중간 및 종료 시점에서 채취해야 합니다. 의료 기기의 경우에는 일반적으로 용액 상태의 추출물을 최대 10개 샘플을 실험하여야 합니다.

결론

LAL 실험 방법 또는 시약 감도의 선택은 Pacific Scientific의 기술담당자/영업 담당자가 성심성의껏 제공할 것입니다.

q